SEC分析中樣品吸附的改善：色譜柱的預(yù)處理

Wyeth BioPharma公司在一項方法優(yōu)化與研究中發(fā)現(xiàn)，在對從細(xì)胞培養(yǎng)原料中經(jīng)多步正交純化得到的表觀分子量為140 kDa的蛋白質(zhì)的各組分進(jìn)行SEC分析時，使用BSA（牛血清白蛋白）對色譜柱進(jìn)行預(yù)處理，顯著提高了重現(xiàn)性和回收率。

Wyeth BioPharma在三步細(xì)胞培養(yǎng)純化的每個階段都會采用SEC分析，以確定目標(biāo)蛋白中高分子量物質(zhì)的純度和回收率。細(xì)胞培養(yǎng)物通過蛋白A親和層析以及后續(xù)的精制步驟進(jìn)行純化。在蛋白A洗脫后片段的SEC分析中，高分子量物質(zhì)區(qū)域的洗脫峰回收率和重現(xiàn)性差異很大，這表明樣品可能吸附在填料上。為了減少這種差異，實(shí)施了用BSA進(jìn)行預(yù)處理的實(shí)驗方案。

分析條件

色譜柱：        TSKgel G3000SWXL（7.8 mmI.D.×30 cm, 5 μm）

流動相：        磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）

樣    品：        進(jìn)樣量50 μL，進(jìn)液50 μg

檢    測：        UV@280 nm

進(jìn)樣量：        10 µL

結(jié)果與討論

如圖1所示，蛋白A純化樣品在高分子量區(qū)域的回收率（%HMW）僅為1.1%。在向色譜柱中注入10份、每份20 μL、濃度為5 mg/mL的BSA后，回收率提高到了3.5%。在未進(jìn)行BSA處理的情況下，從以往的數(shù)據(jù)來看，使用新色譜柱時的蛋白A純化樣品的%HMW值為1.0%～1.4%，而在進(jìn)樣多達(dá)60次后，該值會逐漸上升至3.5%～4.0%。有趣的是，這一結(jié)果僅在蛋白A純化樣品中表現(xiàn)明顯。

圖1  BSA處理前后的蛋白A樣品的疊加圖

表1  BSA處理前后的全部三種樣品的回收率

如表1所示，BSA預(yù)處理對從下游層析步驟中獲得的樣品沒有影響。進(jìn)一步的表征分析表明，與精制后的樣品相比，蛋白A純化樣品中存在較高水平的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）。研究發(fā)現(xiàn)，這些HCP在SEC分析圖譜的HMW區(qū)域被洗脫出來。此外，當(dāng)對BSA處理后的蛋白A純化樣品進(jìn)行SEC分析時，發(fā)現(xiàn)與BSA處理前對同一樣品進(jìn)行SEC分析時的結(jié)果相比，經(jīng)BSA處理后的樣品在HMW區(qū)域中的宿主細(xì)胞蛋白含量更高。這表明，樣品與色譜柱填料之間的相互作用在HCP上表現(xiàn)得最為普遍，而非目標(biāo)分子的HMW物質(zhì)。

研究結(jié)論

用BSA對SEC柱進(jìn)行預(yù)處理可以減少二次相互作用并提高分析間結(jié)果的一致性。在這個特定的實(shí)驗方案中，與下游純化步驟（精制步驟1和步驟2）中HMW回收率未受影響的情況形成對比的是，蛋白A純化組分在結(jié)果一致性方面有了顯著改善，這為進(jìn)一步表征蛋白A純化樣品中的高分子量組分提供了契機(jī)。這一表征工作得出的結(jié)論是，對從早期純化步驟所得樣品進(jìn)行SEC分析的結(jié)果，可能會受到源自細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的非產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的不利影響。

參考文獻(xiàn)

1.       Y. Kato et al; J. of Chromatrogr.404 (1987) 333-339